Zytoflow-Analyse von PBL mit SEAP-Fusionsproteinen

Geräte - Verbrauchsmittel - Reagentien - Protokoll

Geräte:
  • Kühlzentrifuge mit Einsatz für 50 ml Tubes, 15 ml Tubes)
  • Vortexer
  • Pipetten (10µl, 100µl, 1000µl, 10ml)
 Verbrauchsmittel:
  • 15ml und 50ml Tubes
  • Papiertaschentücher
  • Eisbad
  • Ficoll-Röhrchen (50ml)
 Reagentien:
  • Fusionproteine (AP-PLP-A, SEAP), MEM
  • HBHA
  • PBS (4°C)
  • PBS
  • Trypanblau
  • Propidiumiodid-Lösung (20µg/ml PBS)

Protokoll:

  1. Blut abnehmen (blaue Röhrchen, Sarstedt NH4-Heparin, 10 ml), Faustregel: 3 Gpt/l = 3 Mio / ml d.h. in 10 ml sind ca. 30 Mio. Leukos, gebraucht werden ca. 106 pro Ansatz)
  2. Blut in Ficollröhrchen (4°C) überführen (pipettieren, cave! Glaskugeln), zentrifugieren 20' bei 2000 rpm, bei 4°C mit Bremse.
  3. Abpipettieren der Leukozyten (weißer Ring zwischen Filterscheibe und Plasma) und Überführen in 50 ml Röhrchen, PBS auf 50 ml auffüllen, kurz vortexen, zentrifugieren 1200 rpm, 10', 4°C, Überstand dekantieren
  4. Resuspendieren in 1 ml PBS, Aufteilen in zwei 50 ml Tubes,
  5. Inkubieren mit jeweils 5 ml AP-PLP-A (ca. 20-50 mU/100µl) und SEAP und MEM für 30' auf Eis im 50 ml Tube
  6. Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen),
  7. Waschen: Resuspendieren mit 10ml HBHA pH 7.0
  8. Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen)
  9. Einstellen der Zellzahl auf 1-3 x 107 Zellen / ml mit PBS in neuem Röhrchen (Rundboden, Polypropylen > silikonisiertes Glas > Polystyren (z.B. 12 x 75 mm, Falcon 2052). Die vorgegebenen Antikörperkonzentrationen funktionieren bis 10 x 107 Zellen / ml, danach müssen Antikörperkonzentrationen angepaßt werden.
  10. Zugabe des primären Antikörpers: 100µl dazu jeweils 2-10 µg moAB, sonst nach Angaben des Herstellers. Für moAB anti-Human Placental Alkaline Phophatase, Clone 8B6 (SIGMA A2951) 10µl pro 100 µl Probe, Inkubation für 20' bei 4°C,
  11. Waschen: Zugabe von 2 ml PBS (pH7.2) + 0.5% BSA (Serva 11930), kurz vortexen, Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen),
  12. Waschen: Zugabe von 2 ml PBS (pH7.2) + 0.5% BSA (Serva 11930), kurz vortexen, Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen),
  13. Zugabe des sekundären Antikörpers: Zugabe von 100 µl PBS (pH7.2) + 0.5% BSA (Serva 11930), sonst nach Angabe des Herstellers (10µl (ca.1µg) von PE-markiertem Rabbit anti-Mouse IgG (whole Molecule), Sigma P0313), Inkubation für 10' bei 4°C,
  14. Waschen: Zugabe von 2 ml PBS (pH7.2) + 0.5% BSA (Serva 11930), kurz vortexen, Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen),
  15. Waschen: Zugabe von 2 ml PBS (pH7.2) + 0.5% BSA (Serva 11930), kurz vortexen, Zentrifugieren 200 x g oder 1200 rpm, 4°C, 10 min., Überstand dekantieren (letzten Rest auf Zellstoff abtupfen),
  16. Resuspendieren in 250 µl PBS (pH 7.2). Hinzugeben von 150 µl Propidiumiodid-Lösung / Probe. Lagerung auf Eis bis zur Analyse..
  17. Transport in die Hämatologische Speziallabor (Tel. 7523 Labor (Frau Uschi Buchmann), Tel. 7528 Aufenthaltsraum (Dr. Hans-Dieter Kleine)
  18. Messung im Durchflußzytometer. Verzeichnis "UFK", Einstellungen: übernehmen von plpa005 bis plpa008, "FL3 aktiv, parameter saved"

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