Alkalische Phosphatase in situ Assay

Verbrauchsmittel & Geräte - Reagentien - Protokoll - Literatur

Verbrauchsmittel & Geräte:

• drei 50 ml Coplin Küvetten mit Deckel
• Eis, 1.5 ml Eppendorf Röhrchen
• Hydrophober Marker (Pap Pen, Kiyota, Japan, from: Ted Pella Inc. #22303)
• Bleistift oder Permanent Marker
• Feuchte Kammer
• Wasserbad 66°C oder Trockenschrank 67°C
• Papiertaschentücher, Mullkompressen (10 x 10 cm)
• Deckgläschen je nach Objektgröße (22 x 22 mm bis 50 x 24 mm)

Reagentien:

• HBHA (Hanks balanced salt solution with 0.5 mg/ml BSA, 0.1% NaN₃, 20 mM HEPES [pH 7.0])
• HBHA + 0.1% Tween 20
• HBS (HEPES balanced saline)
• AP buffer 2 (Alkaline Phospatase buffer: 100 mM Tris-HCl [pH 9.5], 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂)
• AP stain (AP buffer containing 0.17 mg/ml BCIP and 0.33 mg/ml NBT)
• Acetone / Formaldehyde fixative (60% acetone, 3% formaldehyde, 20mM HEPES, pH 7.0)
• Einbettungsmedium (Aquatex, Fa. Merck, 1.08.562)

Protokoll:

1. Einschalten des 66°C Wasserbades oder 67°C Trockenschrankes. Zur späteren Hitze-Inaktivierung der endogene alkalischen Phosphatase wird eine mit HBS gefüllte Coplin-Küvette plaziert und mit einem Deckel versehen. Die exakte Temperatur in der Küvette ist wichtig.
2. Vorbereiten der Inkubationslösungen, Lagerung bei 4°C oder auf Eis. Eine 50 ml Coplin-Küvette faßt maximal 14 Objektträger. Selbst für kleine Schnitte braucht man wenigstens 200 µl pro Objektträger. Um einen Objektträger vollständig zu bedecken, werden ca. 1 ml benötigt. Zwei verschiedene Negativ-Kontrollen sollten benutzt werden: (a) serumfreies Zellkulturmedium (MEM) um die erfolgreiche Hitze-Inaktivierung der endogenen (d.h. im Gewebe vorhandenen) alkalischen Phosphatase zu prüfen und (b) Zellkulturüberstand mit SEAP (secreted alkaline phosphase), um eine falsch positive Bindung an den Marker SEAP auszuschließen. Um die benötigte Menge an markiertem Protein zu berechnen ist folgende Schätzung hilfreich: SEAP: 1000 mU = 1µg, SEAP-PLx: 600 mU ~ 1µg. Für eine gute Färbung sind Aktivitäten von ca. 10 to 50 mU/ 100 µl in der Inkubationslösung notwendig. Die Aktivität von SEAP sollte gleich oder höher sein als die von AP-PLx.
3. Entnahme der Objektträger aus dem -80°C Gefrierschrank; kurze Lufttrocknung.
4. Einkreisen der Schnitte / Zytospins mit dem hydrophoben Marker (hilft Reagenzien sparen).
5. Beschriften der Objektträger mit Bleistift oder permanent Marker.
6. Rehydrieren für ca. 5 min. in HBHA.
7. Abtropfen und Trockenwischen der Objektträgerkanten und -rückseite mit Mullkompressen (Cave! Nicht innerhalb des markierten Präparates wischen!). Präparate waagerecht in feuchte Kammer legen und vorsichtig mit Inkubationslösungen überschichten. Inkubation bei Raumtemperatur für 75 min. in feuchter Kammer. Die Präparate dürfen zwischen den Schritten nicht trocken werden.
8. Waschen 6 x 5 min. in HBHA + 0.1% Tween 20. Zuerst werden die Objektträger durch Tupfen auf Papierhandtücher drainiert und nach kurzem Spülen in der ersten Küvette sogleich in die zweite plaziert. Intensivieren des Waschens durch leichtes Agitieren zu Beginn, in der Mitte und am Ende der jeweiligen Waschvorgänge.
9. Fixieren mit acetone / formaldehyde fixative für 2 min.
10. Waschen 3 x 5 min. mit HBS (nicht zeitkritisch).
11. Hitze-Inaktivierung der endogenen AP für exakt 30 min. bei 65-67°C (Einsetzen der Objektträger in die vortemperierte Coplin-Küvette mit HBS).
12. Nach Ablauf der Zeit werden die Objektträger für 5 min. in eine Coplin-Küvette mit AP buffer 2 transferiert (zum Kühlen, Spülen und Angleichen von pH und Temperatur).
13. Abtropfen der Objektträger auf Papierhandtüchern, Trockenwischen der Kanten und der Rückseite mit Mullkompressen. Austrocknen der Präparate vermeiden! Inkubieren mit AP-Substrat-Lösung (NBT-BCIP Stammlösung 1:50 mit AP Puffer 2 verdünnen) für 2 Stunden. Eine Verlaufskontrolle des Färbens vor weißem Hintergrund ist vorteilhaft. Die benötigte Zeit kann zwischen 10 Minuten und 16 Stunden variieren. Bei ausreichender Färbung kann die Substratlösung auf Papierhandtüchern abgetropft werden. Vorsicht - der NBT-BCIP-Staub ist toxisch!
14. Spülen der Objektträger 5 x in dH₂O.
15. Einbetten der Präparate mit wasserlöslichem Medium (Aquatex, Fa. Merck, 1.08.562). Zum einbetten mit Permount müssen die Präparate zuvor dehydriert (30 min. Lufttrocknung oder Ethanol- / Xylenbäder). NBT-BCIP ist in Ethanol und Xylen nicht stabil. Die Bildqualität nimmt nach dem Einbetten kontinierlich ab, die Bilddokumentation sollte deshalb sofort erfolgen.

Literatur:

• Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R., and Cullen, B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66(1):1-10, 1988. Medline
• Cao, Y., Chen, H., Zhou, L., Chiang, M.K., Anand-Apte, B., Weatherbee, J.A., Wang, Y., Fang, F., Flanagan, J.G., and Tsang, M.L. Heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. Endothelial activity, tumor cell expression, and high affinity binding to Flk-1/KDR. J.Biol.Chem. 271(6):3154-3162, 1996. Medline
• Cheng, H.J., Nakamoto, M., Bergemann, A.D., and Flanagan, J.G. Complementary gradients in expression and binding of ELF-1 and Mek4 in development of the topographic retinotectal projection map. Cell 82(3):371-381, 1995. Medline
• Cheng, H.J. and Flanagan, J.G. Identification and cloning of ELF-1, a developmentally expressed ligand for the Mek4 and Sek receptor tyrosine kinases. Cell 79(1):157-168, 1994. Medline
• Chiang, M.K. and Flanagan, J.G. PIP NP, a new member of the receptor protein tyrosine phosphatase family, implicated in development of nervous system and pancreatic endocrine cells. Development 122(7):2239-2250, 1996. Medline
• Chiang, M.K. and Flanagan, J.G. Interactions between the Flk-1 receptor, vascular endothelial growth factor, and cell surface proteoglycan identified with a soluble receptor reagent. Growth Factors 12(1):1-10, 1995. Medline

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